DCFH-DA（又称H2DCFDA）是一种能够穿透细胞膜的探针，用于检测细胞内活性氧自由基（ROS），其激发波长为488纳米，发射波长为525纳米。
CAS：4091-99-0
分子式：C24H16Cl2O7
分子量：487.28
使用参考如下：
1.制备染色液
(1)配置储存液:使用DMSO溶解DCFH-DA，配置浓度为1-10mM的储存液。
注意:未使用的储存液分装后在-20℃或-80℃避光保存，避免反复冻融。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。
2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4℃、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS清洗两次，每次5分钟。
(2)贴壁细胞：使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。
(3)加入DCFH-DA工作溶液重悬细胞，37℃避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。
(5)用预温的无血清细胞培养基或PBS孵育细胞。
3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4) 37℃避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用预温的培养液清洗盖玻片2~3次；
(6) 用预温的无血清细胞培养基或PBS孵育细胞。
4.显微镜检测：DCFH-DA的最大激发/发射波长为488/525nm。
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