产品简介：
本试剂盒一种即用型的Western blot相关总蛋白分析试剂, 可通过测量562 nm处的吸光度并与蛋白标准物的吸光度-浓度曲线进行比较, 快速测定总蛋白浓度. 蛋白质定量过程可以在45分钟内完成。
使用说明：
配制参考
Ø以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B. 即将50 ml BCA试剂A与1 ml BCA试剂B混合.
注意: 使用以下公式确定所需工作试剂的总量. (标准品+待测样品) x (重复次数) x (每个样品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液总体积.
Ø按照表1配制新的标准品体系. (用0.9% NaCl或PBS稀释白蛋白 (BSA) 标准液)
表1：白蛋白(BSA)标准品的制备
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Tube Number |
稀释液体积 (μl) |
BSA体积 (μl) |
BSA终浓度 (μg/ml) |
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A |
0 μl |
900 μl of 2 mg/ml Stock |
2000 μg/ml |
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B |
100 μl |
300 μl of tube A |
1500 μg/ml |
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C |
300 μl |
300 μl of tube A |
1000 μg/ml |
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D |
200 μl |
200 μl of tube B |
750 μg/ml |
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E |
300 μl |
300 μl of tube C |
500 μg/ml |
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F |
300 μl |
300 μl of tube E |
250 μg/ml |
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G |
300 μl |
300 μl of tube F |
125 μg/ml |
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H |
400 μl |
100 μl of tube G |
25 μg/ml |
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I |
300 μl |
0 |
0 (blank) |
Ø将0.1 ml的每种标准品和蛋白质样品加入单独的标记试管中.
Ø在每个试管中加入2 ml BCA工作试剂并充分混合.
Ø在37°C下孵育30分钟.
注意：增加孵育时间和温度会增加每次测试的净562 nm吸光度, 并同时降低试剂盒的最低检测水平和测试范围.
Ø将所有管子冷却到室温(RT) .
Ø将分光光度计的波长设置为OD 562nm. 用水将仪器校准为零. 随后, 在10分钟内测量所有样品的吸光度.
注意: 即使冷却至室温后, 色彩仍会继续显影. 但是, 如果所有吸光度测量均在10分钟内进行, 则随后在RT处的显影太弱而不会产生明显的误差.
Ø从所有读数中减去空白的OD562.
Ø绘制BSA标准曲线: OD562 (Y轴) vs BSA标准浓度 (X轴)。 使用标准曲线确定每个待测样品的蛋白质浓度.
微孔参考
Ø以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B. 即将50 ml BCA试剂A与1 ml BCA试剂B混合.
注意: 使用以下公式确定所需工作试剂的总量. (标准品+待测样品) x (重复次数) x (每个样品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液总体积.
Ø按照表2配制新的标准品体系. (用0.9% NaCl或PBS稀释白蛋白 (BSA) 标准液)
表2：白蛋白(BSA)标准品的制备
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Tube Number |
稀释液体积(μl) |
BSA体积 (μl) |
BSA终浓度 (μg/ml) |
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A |
0 μl |
200 μl of 2 mg/ml Stock |
2000 μg/ml |
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B |
30 μl |
90 μl of tube A |
1500 μg/ml |
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C |
60 μl |
60 μl of tube A |
1000 μg/ml |
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D |
60 μl |
60 μl of tube B |
750 μg/ml |
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E |
60 μl |
60 μl of tube C |
500 μg/ml |
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F |
60 μl |
60 μl of tube E |
250 μg/ml |
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G |
60 μl |
60 μl of tube F |
125 μg/ml |
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H |
100 μl |
25 μl of tube G |
25 μg/ml |
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I |
60 μl |
0 |
0 (blank) |
Ø将25μl的每种标准品和蛋白质样品添加到单独的微孔板孔中。
Ø向每个孔中添加200μlBCA工作试剂并混合。
Ø密封板并在37°C下孵育30分钟。
Ø将板冷却至室温(RT).
Ø在10分钟内在读板器上测量562 nm的吸光度.
Ø从所有读数中减去空白的OD562. 绘制BSA标准曲线: OD562 (在Y轴上) 对BSA标准浓度 (在X轴上). 使用标准曲线确定每个待测样品的蛋白质浓度.
注意事项
Ø如果将本试剂盒冷藏或存放在冷库中, 则试剂A或试剂B中可能会形成沉淀物. 要溶解沉淀物, 请在37°C下缓慢加热溶液, 同时进行混合或微波处理几秒钟. 如果试剂盒被细菌污染, 则将其丢弃.
Ø如果样品中仍然存在还原性物质或金属螯合物而引起干扰, 建议使用Bradford分析试剂盒.
Ø建议一式两份地测定不同浓度和样品的标准液. 每种测定均应绘制标准曲线.
Ø彻底混合试剂A和试剂B后, 新形成的绿色浊度将消失. 它不会影响性能.
Ø使用分光光度计检测蛋白质浓度时, 测定的样品量将减少. 使用37°C的培养箱时, 请防止水蒸发的影响.
Ø消除或最小化干扰物质影响的几种方法:
•通过透析或凝胶过滤去除干扰物质.
•稀释样品，直到物质不再干扰为止.
•由于高浓度的去污剂也会影响结果, 因此请用三氯乙酸 (TCA) 沉淀样品中的蛋白质.
Ø避免使用包括还原性物质, 螯合剂, 强酸和强碱在内的物质, 因为即使浓度很低也会干扰蛋白质的估算.
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暂无参考文献
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