产品简介：
Ø本产品采用独特的疏水膜技术，彻底去除样品中蛋白和DNA等干扰物，从而提取高纯度的RNA。试剂盒采用独特的缓冲系统，可从多种不同类型的动植物组织、细胞中快速提取总RNA。本试剂盒提取得到的RNA纯度较高，去除抑制下游反应的物质，避免因RNA不纯引起实验失败。
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组份 |
BKM-RTQ-K50(50次） |
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Mini Column |
50 |
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2 ml Collection Tube |
50 |
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Buffer KB (Column solution) |
30 ml |
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Buffer KL (Lysis solution) |
50 ml（4 ℃保存） |
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Buffer KRW (Wash solution) |
50 ml（4 ℃保存） |
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Buffer KRE (RNA-elution solution ) |
15 ml（4 ℃保存） |
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Buffer KW1 (Wash solution 1) |
50 ml |
使用说明：
1. 实验前准备工作：详细阅读该手册熟悉各步骤，并准备好所有的试剂盒组分、1.5 ml和2 ml RNase-free灭菌离心管、75%乙醇、异丙醇、巯基乙醇以及65℃的温浴条件。实验过程中使用的离心管如未加说明，均为RNase-free灭菌离心管。
2. RNase酶是导致RNA降解最主要的物质，但是它广泛存在于环境中，并且非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌法和蛋白抑制剂都不能使其完全失活。因此，在进行与RNA制备有关的分子生物学实验时，需严格遵守以下规范：
1）提取总RNA前，需提前处理实验所用的器皿和仪器。移液器一般情况下可以用RNase-free水配制的75%乙醇擦洗移液器的内部和外部；研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180 ℃烘干4 h以上；枪头、离心管等塑料器皿需用RNase-free水配制的0.1%（v/v）DEPC水（DEPC具有致癌性，操作时需戴手套）浸泡12h后，再高压蒸汽灭菌后使用；75%乙醇需用DEPC水配制。
2) 电泳槽等可以用0.2M 的NaOH 浸泡，并用纯水漂洗。
3）全程佩戴一次性手套，并且经常更换。RNase广泛存在于人体皮肤上，佩戴一次性手套可以避免RNase的污染。
操作步骤：
（一）平衡吸附柱
1. 取一 Mini Column柱装在一个2 ml收集管上（已备）。加入500μl Buffer KB平衡液至柱子內，室温13000 rpm离心1 min，使平衡液完全流过柱子。弃收集管中的滤液，将空柱套回收集管内。
注意：柱子不平衡，将导致RNA产率和纯度减少。
（二）样品处理
2. 按每1 ml KL加10μl的比例将Beta-巯基乙醇加入到KL中，此溶液一个星期稳定。（省略巯基乙醇在大部分情况下是可以的。）。
3. 组织破碎：可根据不同样品选择适合的方法
1）液氮研磨：按10-50 mg组织将组织直接放入研钵，加入少量液氮，迅速研磨，再加少量液氮，再研磨，如此三次，将样品研成粉末。用药匙迅速将样品干粉转入到1.5 ml离心管中。加入700-1000 μl 的KL，混匀2min.
2）直接研磨：对于新鲜植物组织，将组织直接放入研钵，按50 mg组织/1 ml比例将KL加入研体，直接在KL中将样品研磨匀浆后，转入一新的1.5 ml离心管（推荐）。
3）匀浆器法：将10-50 mg组织样品放入预先装有700-1000μl 的KL的离心管中，用电动匀浆器充分匀浆约1-2 min。注意：组织体积不能超过KL体积的10%，否则匀浆效果会不好。
4）从细胞中提取：对于贴壁细胞，按照10 cm2/1 KL ml比例加入KL，用移液器吹打数次，进行消化裂解；对于悬浮细胞可离心收集后，每5×106动物、植物或酵母细胞或者107细菌细胞加入1 ml KL进行裂解。
注意：1）液氮研磨法中，研磨和样品转移要动作迅速，保持样品始终为冻干状态。
2）直接研磨法中，可以在通风橱中进行，避免巯基乙醇造成的恶臭味。
3）省略巯基乙醇在大部分情况下是可以的。
4. 将裂解液在4 ℃ 或室温下13000 rpm 离心5min。
（三）吸附
5. 将上清液转移至新的2ml离心管，加入等体积的70%的乙醇溶液，颠倒混匀。（注意，70%的乙醇溶液必须用DEPC 水现配现用，否则会导致RNA 降解）
6. 将混合液（包括可能的沉淀）转至已平衡的吸附柱內，室温或4 ℃ 13000rpm离心30 s，使液体完全流过柱子。保留柱，弃去收集管中的过滤液，将吸附柱重新放入收集管。
注意：如混合液体积过大，可分成数次上柱，每次上样量不要超过700 μl。
9. 把吸附柱装入2 ml收集管中，加700μl 的70%乙醇至柱中或4℃，13000 rpm离心1 min，保留柱，弃去收集管中的过滤液。（注意，70% 的乙醇溶液必须用DEPC的水现配现用，否则会导致RNA 降解）
10. 将柱子重新套回2 ml收集管内。4 ℃ 13000 rpm或最高转速离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。
注意：此步骤不可省，否则将导致乙醇残留于RNA中，影响后续反应。
（五）洗脱
11. 把柱子装在一个新的1.5 ml离心管上，加入30-50 μl（室温）的KRE到柱基质膜的中央，室温放置2 min。4 ℃ 13 000 rpm离心1 min以洗脱RNA。
注意：1）小心加KRE到柱中吸附膜的中间部位，确保液体将膜全部覆盖。
2）Karroten 不保证开启的KRE会一直保持RNase-free 状态。可用自己信赖的RNase-free水代替KRE。
12. RNA应保存于-20 ℃，若长时间保存，应冻存于-70 ℃。
注意：提取的RNA应尽快进行后续实验。
注意事项：
Ø如不慎接触皮肤可立即用大量的洗涤剂和清水清洗。
Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴 一次性手套操作。
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